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徒手切割法體細胞克隆研究進展
日期：2025-04-12 07:21
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摘要：
1997年2月，英國<Nature》雜志報道了英國羅斯林研究所的Wilmut等利用綿羊乳腺細胞進行核移植試驗，成功地獲得了世界上**只體細胞克隆綿羊——多利(Dolly)。這一成果有力地證明了成年哺乳動物的體細胞仍具有發(fā)育上的全能性，從而開創(chuàng)了哺乳動物細胞核移植的新里程碑，在生物科學(xué)史上具有十分重要的意義。到目前為止，體細胞克隆技術(shù)已相繼在多種動物上獲得成功，并顯示出巨大的應(yīng)用潛力和社會效益。
目前影響動物體細胞核移植廣泛應(yīng)用的主要技術(shù)因素有：
(1)核移植效率低；
(2)實驗所需設(shè)備費用高。技術(shù)難度大；
(3)妊娠率和產(chǎn)仔率低，出生后死亡及異常發(fā)育率高。
在克隆過程中成熟卵母細胞去核是核移植技術(shù)中的一個重要環(huán)節(jié)。要求去得干凈，又盡可能地減少對細胞質(zhì)的損傷。如果去核不完全，可導(dǎo)致重組胚染色體的非整倍性，造成多倍體，卵裂異常，發(fā)育受阻和胚胎早期死亡。而如果要保證去核勢必要損失細胞質(zhì)，否則要使用熒光染色技術(shù)。目前使用的主要是顯微操作去核，需要價格昂貴的顯微操作儀和熟練的技術(shù)操作人員。此外，還需要相關(guān)的輔助工具制作設(shè)備如研磨機、微鍛爐等，而對其使用也需一定的技術(shù)水平。這些要求相當(dāng)程度地限制了核移植技術(shù)的簡化及廣泛應(yīng)用。研究不需要顯微操作設(shè)備的核移植技術(shù)將會對體細胞核移植技術(shù)的實際應(yīng)用起到巨大推動作用。
1 HMC技術(shù)
徒手切割法體細胞克隆(Handmade Somatic Cell Cloning，HMC)是一項不需要顯微操作的核移
植方法，*早是Peura等 進行牛胚胎細胞克隆時建立的，Vajta等【3 進一步發(fā)展了此方法，成功應(yīng)用
于牛的體細胞核移植，并且得到后代 。HMC技術(shù)路線主要包括卵母細胞的去透明帶，徒手切割半卵
法去核，雙半卵融合、激活，以及支持無透明帶卵／胚胎培養(yǎng)技術(shù)。
1．1 卵母細胞去透明帶
1．2 卵母細胞的去核
1．3 卵母細胞的融合
目前常用的是電融合，根據(jù)電融合的次數(shù)可以分為一步法和兩步法。融合的電壓與動物的種類有關(guān)。BLS細胞融合儀是一款專門為哺乳動物設(shè)計的細胞融合儀，產(chǎn)品小,易操作,性價比極高.HMC技術(shù)結(jié)合BLS細胞融合儀CF-150B的使用,已成為此領(lǐng)域研究人員的理想選擇.
1．3．1 一步法
在電融合槽中一次同時將2枚去核后的半卵和1枚供核體細胞粘合在一起進行融合，從而提高電擊融合效率。
具體做法是：
將半卵細胞與供體細胞先放入含有植物凝集素(PHA)的TCM～HEPES液滴中，通過圓頭粘合細玻璃針撥動使一枚半卵先與一枚供體細胞粘合，然后再與另一枚半卵粘在一起，其排列順序為：體細胞一半卵～半卵，然后進行電融合。在融合槽中施加交流電場，可使已經(jīng)粘成一串的3個細胞自動排序，再給與直流電脈沖，可以一次性同時融合處理14個3細胞串，從而大大提高融合效率。電擊后3Orain內(nèi)觀察融合情況，沒有融合的再進行電擊一次。
在牛的電融合實驗中，其融合率達到(95．68±3．97) ]。利用一步融合法已經(jīng)生下5頭體細胞克隆牛
犢。也可以采用先將一枚半卵與一枚供體細胞用PHA法粘合，然后放入融合槽時再加入一枚半卵。
通過手工撥動使粘有體細胞的半卵與另一枚半卵排序，然后通過提供一定電壓的交流電場使3個細胞
緊密聯(lián)結(jié)在一起，再應(yīng)用直流電脈沖一次性使3個細胞融合，一次可以融合處理4對細胞。
1．3．2 兩步法
相對一步法而言，主要是進行兩次電融合。
具體過程：
半卯與供體細胞經(jīng)過有植物凝集素(PHA)的TCMHEPES液滴的處理后，一枚半卵先與供體細胞融合，融合后的半卵再與另一枚半卵進行融合，但是**次融合的電壓要比**次的低。根據(jù)Vajta等的報道，經(jīng)過兩次融合，融合率可以達到76。運用此法進行核移植也得到克隆牛犢-4。j。
1．4 卵母細胞的激活
激活處理主要是化學(xué)激活，與常規(guī)相同。但也有化學(xué)激活與電激活相結(jié)合的。采用化學(xué)激活時去
透明帶的卵母細胞在二甲氨基嘌呤(DMAP)中采用微穴培養(yǎng)系統(tǒng)(WOW)培養(yǎng)法，一般每孔3O～100
個，具體依據(jù)實驗的細胞數(shù)目而定。Kragh等 用HMC技術(shù)進行豬的體細胞核移植時使用化學(xué)激活和
電激活相結(jié)合的方法，激活率為(49±1) 。
1．5 重構(gòu)胚的培養(yǎng)
與傳統(tǒng)核移植重構(gòu)胚的培養(yǎng)方法不同，HMC的胚胎由于去除了透明帶，其培養(yǎng)系統(tǒng)必須要能夠防
止重構(gòu)胚的相互粘連，因而采用隔離法群體培養(yǎng)。
1．5．1 微穴培養(yǎng)系統(tǒng)(well of the well，WOW)
WOW *先報道于Vajta等 ，其簡要過程如下：在四孔培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液并覆蓋石蠟油預(yù)熱，然后用胚胎聚集針通過手腕用力并旋轉(zhuǎn)，在培養(yǎng)皿的底部均勻分布地壓下30～70個(視每組實驗培養(yǎng)的卵母細胞數(shù)而定)圓錐形小凹。小凹的底部直徑約為120n，上口直徑約300 f』m，深度約為350 n 。
1．5．2 明膠一孔系統(tǒng)
用胚胎培養(yǎng)液無牛血清白蛋白(BSA)和氨基酸]溶解明膠，濃度為19／6。在四孔板的孔中鋪上一層明膠，然后加入胚胎培養(yǎng)液并在上面覆蓋石蠟油。用直徑為5O～100rn的塑料小管在明膠上作孔，每孔放一個胚胎進行培養(yǎng)。
1．5．3 微管法培養(yǎng)(GO 系統(tǒng))
GO系統(tǒng)(the glassoviductsystem)就是將重構(gòu)胚放人一端封Vi的毛細玻璃管中，玻璃管徑的大小要適宜，將培養(yǎng)液加入到玻璃管中然后進行培養(yǎng)。Thouas等在研究小鼠的合子體外發(fā)育時，發(fā)現(xiàn)GO系統(tǒng)培養(yǎng)的囊胚其內(nèi)細胞團、滋養(yǎng)外胚層以及早期桑椹胚的細胞數(shù)目明顯高于微滴法培養(yǎng)囊胚的細胞數(shù)，但操作不如微滴法簡便。
1．6 核移植胚胎的冷凍
2 HMC技術(shù)的應(yīng)用前景
與常規(guī)核移植方法相比，HMC技術(shù)*大的特點是對實驗設(shè)備的要求相對而言不是太高，不需要顯
微操作儀，而且對技術(shù)人員的要求也降低許多。常規(guī)去核方法主要依靠**極體定位，因此需要必須是有**極體排出的成熟卵母細胞；而HMC技術(shù)則不需要那么嚴格，只要成熟的卵母細胞細胞質(zhì)均勻即可，從而可以提高卵母細胞的利用率。但HMC技術(shù)需要兩個卵母細胞才能得到一個重組胚，因而從整體上限制了核移植的成功率，但是核移植的效率卻可以大大提高。此外由于在融合時兩個半卵胞質(zhì)體來自不同的卵母細胞再加上供體細胞，重構(gòu)胚的DNA有可能來源于三方面，對胚胎的進一步發(fā)育可能會產(chǎn)生影響。
目前通過此方法得到克隆動物還不多，只有牛的成功報道，但是在其他動物如豬 、綿羊現(xiàn)在也展開了研究，并且取得了一定進展。Vanessa等用HMC技術(shù)進行牛的體細胞連續(xù)核移植(SHMC)，成功得到一頭小牛。同時HMC技術(shù)有獨特的優(yōu)勢如進行胚胎嵌合的研究]?？傊琀MC技術(shù)由于其獨到的優(yōu)勢，將會促進核移植技術(shù)的發(fā)展。隨著該方法進一步的提高和完善，HMC技術(shù)在哺乳動物的體細胞克隆胚胎產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中將發(fā)揮重要作用。
BLS細胞融合儀與HMC技術(shù)相結(jié)合,以成為該領(lǐng)域研究人員的理想選擇
