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活體生物發(fā)光成像技術(shù)的*新進(jìn)展(二）
日期：2024-12-28 19:52
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摘要：
有幾種常用的熒光素酶？特性如何？
有兩種常用的熒光素酶，luciferase 和renilla的熒光素酶，二者的底物不一樣，前者的底物是luciferin，后者的底物是coelentarizine。二者的發(fā)光顏色不一樣，前者所發(fā)的光波長在540-600nm，后者所發(fā)的光波長在460-540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織。后者在體內(nèi)的代謝比前者快，但由于coelentarizine的原因，會有一些非特異性發(fā)光。所以，通常使用前者用作報(bào)告基因。
熒光素酶的發(fā)光特性如何？
熒光素腹腔注射老鼠后約一分鐘后表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞開始發(fā)光，十分鐘后強(qiáng)度達(dá)到*高。在*高點(diǎn)持續(xù)約法20-30分鐘后開始衰落，約三小時(shí)后熒光素排除，發(fā)光全部消失。所以，*好的檢測時(shí)間是在注射后15到25分鐘之間。
熒光素酶的發(fā)光是否需要激發(fā)光？
熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素(LUCIFERIN)。熒光素是一種水溶性和脂溶性都非常好的小分子，很容易穿透細(xì)胞膜和血腦屏障。
如何保證熒光素酶(Luciferase)的穩(wěn)定性？
熒光素酶基因是插到細(xì)胞染色體內(nèi)的，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí),熒光酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。熒光素酶的半衰期約三個(gè)小時(shí), 所以只有活細(xì)胞才能夠持續(xù)表達(dá)熒光素酶。
標(biāo)記的腫瘤接種以后，會發(fā)生luciferase的丟失嗎？
從理論上會，但是還沒有正式的報(bào)道。丟失的量，非常小，可以忽略不記，不會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)腫瘤傳很多代長很大時(shí)，已經(jīng)有很多細(xì)胞死亡，不具有觀察的意義。
如何定量分析？
采取**光子數(shù)的計(jì)算方法，記錄單位時(shí)間內(nèi)、單位面積、單位角度接受到的光子數(shù)。這樣，不同時(shí)間、不同儀器的測量結(jié)果可以進(jìn)行比較，具有**的定量意義。每一個(gè)新標(biāo)記的細(xì)胞株都要進(jìn)行**的定量分析才能用于定量實(shí)驗(yàn)，其中包括在體外和體內(nèi)固定位置細(xì)胞發(fā)光的標(biāo)準(zhǔn)曲線。提供的每一種熒光酶標(biāo)記的細(xì)胞株都做過****的分析。我們也為客戶免費(fèi)提供這些分析的方法。
儀器的解析度如何？分辨率如何？
儀器的*高解析度在0.1毫米左右。*新的儀器IVIS 200的*高解析度可達(dá)到60um,在體外可觀察到單個(gè)發(fā)光細(xì)胞。由于可見光是漫射光，在體內(nèi)走的路線不是直線，所以該儀器的體內(nèi)光源的分辨率不是很好，通過該儀器觀察的發(fā)光圖片不能代表發(fā)光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，在動物體表所捕捉的發(fā)光信號只能代表發(fā)光的強(qiáng)度和大概的位置。小動物CT和MRI，在這方面具有優(yōu)勢，因?yàn)榉派渚€走的路線很直。
發(fā)光的波長與體內(nèi)的穿透性如何關(guān)系？
熒光素酶發(fā)出的光主要是偏紅光，與綠色熒光蛋白(GFP)的綠色熒光不同。熒光素酶的偏紅光比綠色熒光蛋白的綠光在體內(nèi)的穿透性要強(qiáng)近一百倍。因?yàn)楣庠诓溉閯游锝M織內(nèi)傳播時(shí)會被散射和吸收，不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內(nèi)可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍(lán)綠光波段的大部分。但是在可見光大于600納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區(qū)域,大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。
可以用熒光素酶基因標(biāo)記干細(xì)胞嗎？如何標(biāo)記？
可以，標(biāo)記干細(xì)胞有兩種方法。一種是標(biāo)記組成性表達(dá)的基因，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，干細(xì)胞就被標(biāo)記了，從此小鼠的骨髓取出造血干細(xì)胞，移植到另外一只小鼠的骨髓內(nèi)，可以用該技術(shù)示蹤造血干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和分化及遷徙到全身的過程。另外一種方法是用慢病毒標(biāo)記干細(xì)胞。以上內(nèi)容都有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。
該技術(shù)在抗腫瘤新藥研究方面的應(yīng)用如何？
在用該技術(shù)進(jìn)行抗腫瘤新藥的研究方面，主要是藥效學(xué)評價(jià)。用活體成像的方法比傳統(tǒng)技術(shù)有更高的靈敏度，當(dāng)用傳統(tǒng)的方法，還不能檢測到瘤塊時(shí)，用該技術(shù)已經(jīng)可以檢測到很強(qiáng)的信號。還有由于該技術(shù)只是檢測活躍的細(xì)胞，那些已經(jīng)凋亡的癌細(xì)胞是檢測不到的，而用傳統(tǒng)的方法，不能區(qū)別正常的癌細(xì)胞與凋亡的癌細(xì)胞，所以該技術(shù)可以比傳統(tǒng)技術(shù)更早的發(fā)現(xiàn)**的療效，比傳統(tǒng)方法更靈敏。目前已經(jīng)應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行的抗腫瘤藥效研究的有SU11248（很可能上市的乳腺癌新藥），Topotecan（已經(jīng)上市的抗腫瘤新藥）等。
