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細胞融合技術(shù)的應用研究進展
日期：2024-12-28 08:50
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摘要：
人們很早就注意到了在自然條件下發(fā)生的細胞融合現(xiàn)象，首先在病料組織中發(fā)現(xiàn)了由細胞融合產(chǎn)生的多核細胞，緊接著發(fā)現(xiàn)在脊椎動物和無脊椎動物的正常細胞中也可發(fā)生細胞融合，隨后在體外組織培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)了離體細胞的融合現(xiàn)象。自從發(fā)現(xiàn)活病毒可在體內(nèi)介導癌細胞融合后，人們又實現(xiàn)了利用滅活病毒促進動物異種細胞融合，從而打破了細胞融合的種屬屏障，推動細胞融合技術(shù)躍上新的
臺階。原生質(zhì)體的大量制備較為困難，限制了植物細胞融合技術(shù)的發(fā)展，因此植物細胞融合的起步較動物細胞融合要遲10年左右。直到用酶法大量制備有活力的原生質(zhì)體獲得成功后，才使植物原生質(zhì)體的融合工作迅速發(fā)展起來。由于病毒誘導細胞融合存在著病毒制備困難、操作復雜、滅活病毒的效價差異大等原因，人們又找到了比病毒簡便、快速和高效且比病毒更易制備和控制，活性穩(wěn)定，使用方便的化學物質(zhì)PEG作為病毒的替代物誘導細胞融合，但在PEG誘導細胞融合的有效的濃度范圍內(nèi)(50～55)對細胞毒性很大，因此人們又找到了新的方法來替代PEG，這些新方法有電脈沖誘導細胞融合技術(shù)和激光融合技術(shù)以及空間融合技術(shù)等。縱觀細胞融合技術(shù)的發(fā)展歷史，該技術(shù)的不斷改進首先表現(xiàn)在融合劑上，從致癌活病毒到滅活病毒再到化學物質(zhì)，其次體現(xiàn)在新方法上，再者體現(xiàn)在融合對象的不斷擴展上?，F(xiàn)在新的細胞融合方法一般采用將化學法和物理法結(jié)合起來進行，如將磁、超聲、機械等和激光、電相結(jié)合，同時添加化學劑以便進一步提高融合率，細胞融合的方法和手段始終朝操作方便、簡單，便于量化研究，同時融合率又能得到不斷提高的
方向發(fā)展。
1． 細胞融合的意義
所謂細胞融合就是指在外力(誘導劑或促融劑)作用下，兩個或兩個以上的異源(種、屬間)細胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細胞的現(xiàn)象稱為細胞融合或細胞雜交口]。如取材為體細胞則稱體細胞雜交，體細胞融合后可形成四倍體或多倍體細胞，由此形成的雜交細胞，其特性會有很大的變化。細胞融合不受種屬的局限，可實現(xiàn)種間生物體細胞的融合，使遠緣雜交成為可能，因而是改造細胞遺傳物質(zhì)的有力手段。它的意義在于從此打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限和生殖壁壘，極大地擴大了遺傳物質(zhì)的重組范圍；細胞融合技術(shù)避免了分離、提純、剪切、拼接等基因操作，在技術(shù)和儀器設備上的要求不象基因工程那樣復雜，投資少，有利于廣泛開展研究和推廣，有著重大的實踐意義，正得到科學界的日益重視[2_引。經(jīng)過長期反復研究和實踐，細胞融合技術(shù)逐步發(fā)展和完善起來，已成為生物工程的基礎技術(shù)之一。特別是近20年來，從理論和實踐兩個方面，有力地推動了生物科學各領域的發(fā)展。細胞融合方法得到了不斷的更新，融合率也得到逐步的提高。
2． 動物細胞融合技術(shù)
動物細胞融合是從細胞水平來改變動物細胞的遺傳性，用于生產(chǎn)單克隆抗體、疫苗等特定的生物制品，改良培育動物新品種，縮短動物的育種過程。動物細胞融合的應用范圍已廣及生物學的各個分支學科，特別是在繪制人類基因圖譜方面取得了顯著成績。雖然細胞雜交屬于理論生物學范疇，但在實際應用方面也有重大突破。在基礎理論研究上，動物細胞融合技術(shù)對研究細胞分化、基因定位、腫瘤發(fā)生機制等方面都有重要意義。在實際應用方面，動物細胞融合技術(shù)在**定向釋放系統(tǒng)、細胞**以及抗腫瘤**等方面起到重要的用。動物體細胞雜交技術(shù)主要應用于以下幾個方面。
2．1 用于基因定位和繪制人類基因圖譜
雜種細胞中某一染色體或其片段的存在與否與細胞的某一性狀表達與否相聯(lián)系，從而可以實現(xiàn)把基因定位于某一染色體或某一區(qū)段上。1967年Weise和Green發(fā)現(xiàn)在人和鼠的融合細胞中，人的染色體優(yōu)先丟失，并證明利用這一特點有可能對人染色體上的
基因進行定位。1970年Ruddle等開始系統(tǒng)地用融合細胞作為實驗系統(tǒng)來繪制人類基因圖。
2．2 用于生產(chǎn)樹突狀細胞抗腫瘤疫苗
一般認為腫瘤細胞表面抗原不能誘導強的**應答反應，樹突狀細胞(dendriticcells，DCs)與腫瘤細胞融合形成的樹突狀細胞疫苗能夠有效地激發(fā)機體的細胞**應答，無論是在動物研究還是在人體早期臨床試驗中都證明這是一種方便、**、可行的方法[4]。并且由于融合細胞可以在體內(nèi)存活，因此可以維持較長時期的**應答，有利于誘發(fā)機體產(chǎn)生有效的抗腫瘤**。腫瘤抗原可以肽段或完整蛋白的形式與DCs結(jié)合，或者將腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)化進DCs中，使其內(nèi)源性地表達抗原，這兩種方法在抗腫瘤**應答中均有效-9]，但適于**的腫瘤抗原及其基因難以鑒定從而限制了其應用]，有實驗證明用這兩種方法制備的腫瘤疫苗的**原性不及腫瘤細胞與樹突狀細胞直接融合的異核細胞，融合細胞保持了DCs和腫瘤細胞的特性，并且能高效地將未知的腫瘤抗原提呈給**系統(tǒng)，今后腫瘤疫苗的研
究工作將集中在疫苗的純化上，以期用高度純化的雜合細胞來激發(fā)更為有效和強烈的**應答反應，使得這種方法在臨床應用中更為實際.
2．3 用于生產(chǎn)單克隆抗體
使小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合形成能產(chǎn)生單克隆抗體(monoclonalantibody，McAb)的雜交瘤細胞，單克隆抗體具有專一性和靈敏性，作為理論研究的工具在病原檢測和****以及食品**領域具有廣闊的應用前景。1985年，中科院上海細胞生物學研究所研制成功抗北京鴨紅細胞和**細胞表面抗原的單克隆抗體，同時還與有關(guān)醫(yī)學部門合作，成功地制備了抗人肝癌和肺癌的單克隆抗體。在神舟**上我國自制的細胞電融合儀分別進行了植物細胞的電融合試驗和動物細胞的電融合試驗，動物細胞電融合實驗采用純化的乙肝疫苗病毒表面抗原**的小鼠B**細胞和骨髓瘤細胞，目的是獲得乙肝單克隆抗體。目前有關(guān)單位利用McAb作用的專一性這一特點正在探索用“生物導彈”對癌癥進行早期診斷和**。
2．4 用于動物育種
體細胞核移植技術(shù)(somatic cell nucleartransfertechnique，SCNT)是將細胞核移植到另一細胞的細胞質(zhì)中的生物技術(shù)。動物體細胞融合后，雜種細胞難以發(fā)育再生為一個個體，但借助于細胞核移植的方法將融合后雜種細胞的細胞核移入去核成熟卵內(nèi)，可培育新的雜種。另外，細胞核移植技術(shù)的建立，還為目前進行的哺乳動物體細胞克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)打下良好的實驗基礎[1]。
2．5 用于細胞療法
SCNT將患者的任何體細胞與去核卵細胞融合，融合子進行有絲分裂形成囊胚，囊胚的內(nèi)細胞團是多能干細胞，對多能干細胞進行誘導使其定向分化可形成所需的組織和器官用于器官移植，不僅解決了器官和組織來源問題，并且也避免了宿主對外來物的**排斥。
2．6 動物體細胞融合在基礎理論研究方面的應用
(1)用于研究細胞的核質(zhì)關(guān)系和個體發(fā)育。
2o世紀7O年代初，誕生了細胞拆合工程。Carter于1967年發(fā)現(xiàn)細胞松弛素B(CB)能誘發(fā)體外培養(yǎng)的小鼠L細胞的排核作用。Prescott等1972年首先應用離心術(shù)結(jié)合CB分離哺乳類細胞的胞質(zhì)體獲得成功，為研究哺乳類細胞的核、質(zhì)相互關(guān)系、細胞質(zhì)基因的轉(zhuǎn)移開創(chuàng)了新的途徑C1zJ。異核體和細胞雜合子被用來確定基因調(diào)節(jié)因子，這些調(diào)節(jié)因子決定一個細胞表型消失或得以保持以及賦予受體新性狀；通過對供體和受體細胞所有細胞特異性基因表達研究，細胞融合有助于人們了解發(fā)育，特別是在研
究基因編碼的可逆性方面。在個體發(fā)育過程中，血紅蛋白存在著從胚胎型向胎兒型(幼蟲)*終向**型的轉(zhuǎn)換，對這些轉(zhuǎn)換進行研究，除了揭示基因順序表達的調(diào)控機理外，在醫(yī)學方面也有意義，人們可以部分或全部扭轉(zhuǎn)從胚胎型向胎兒型的轉(zhuǎn)變從而**鐮刀型貧血病。
(2)用于揭示**發(fā)生的機制。
與其他技術(shù)結(jié)合使用，細胞融合是一種揭示**機理的有效方法。例如，細胞融合與**熒光，生化分析，電鏡技術(shù)相結(jié)合，LattanziG等對肌肉萎縮癥發(fā)生的機理進行了研究cH]。
(3)用于膜蛋白動力學研究。
細胞融合技術(shù)與顯微鏡技術(shù)結(jié)合使用被用來研究膜蛋白動力學以及這些膜蛋白之間的關(guān)系，P6terNagy等的研究發(fā)現(xiàn)大型膜蛋白群之間(主要組織相容性復合物majorhistocompatibilitycomplex，MHC，包括MHC I和MHClI)發(fā)生蛋白質(zhì)交換，并且群內(nèi)蛋白之間也發(fā)生蛋白移位，小蛋白群之間也存在著蛋白重排現(xiàn)象。
3． 植物細胞融合技術(shù)
植物細胞融合技術(shù)目前主要是作為擴大變異的手段，同時也正朝著將抗藥性和胞質(zhì)雄性不育等細胞質(zhì)基因?qū)肆硪粋€體細胞的方向發(fā)展，有可能形成新的核質(zhì)雜種。如果獲得了有用性狀的細胞系，在還不能形成植株時，就可以通過快速大量繁殖細胞加以利用。在生產(chǎn)應用研究方面，植物細胞融合在育種上有重要的應用價值，通過誘導不同種問、屬問甚至不同科問原生質(zhì)體的融合，可能打破有性雜交不親和性的界限，廣泛地組合各種基因型，從而有可能形成有性雜交方法所無法獲得的新型雜種植株；另一方面又可將各種細胞器、DNA、質(zhì)粒、病毒、**等外源遺傳物質(zhì)引入原生質(zhì)體，從而有可能引起細胞遺傳性的改變，為某些**植物的快速繁殖、植物的復壯等提供了可行的方法，應用于植物育種、種質(zhì)保存、無性系的快速繁殖和有用物質(zhì)生產(chǎn)等。植物細胞融合配合常規(guī)育種技術(shù)，可望選出優(yōu)良材料，加之體細胞雜交來自雙親的遺傳物質(zhì)并非簡單的堆積，而是發(fā)生了復雜的遺傳重組，這正是改良作物所期望的。植物細胞融合的作用主要表現(xiàn)在以下方面：通過植物細胞融合培育抗病新材料；合成新的物種，轉(zhuǎn)移細胞質(zhì)基因。原生質(zhì)體新培養(yǎng)體系的研究將會提高融合率。YamagishiH等[】設計了一種新的高效原生質(zhì)體培養(yǎng)體系，增加了不對稱雜交屬內(nèi)種間細胞融合率可以設想，細胞融合技術(shù)發(fā)展后，可以把人參和蟲草的細胞融合，產(chǎn)生新的品種，并具備它們各自特有的
藥效，這是非常有意義的事。
4． 微生物細胞融合技術(shù)
用于植物和微生物育種是細胞融合技術(shù)*基本的應用領域。對微生物而言，該技術(shù)主要用于改良微生物菌種特性、提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量、使菌種獲得新的性狀、合成新產(chǎn)物等。與基因工程技術(shù)相結(jié)合，使對遺傳物質(zhì)進一步修飾提供了各種各樣的可能性。目前，微生物細胞融合的對象已擴展到酵母、霉菌、**、放線菌等多種微生物的種間以至屬間，不斷培育出用于各種領域的新菌種。自1979年匈牙利的Pesti首先利用微生物原生質(zhì)體融合技術(shù)提高青霉素產(chǎn)量以來，開創(chuàng)了原生質(zhì)體融合技術(shù)在實際工作中的應用。微生物細胞融合技術(shù)的一項突出應用是生物藥品的生產(chǎn)，包括***、生物活性物質(zhì)、疫苗等，它適用于**的診斷、預防及**等。另一方面的突出應用就是為發(fā)酵工業(yè)提供優(yōu)良菌種，例如日本味之素公司應用細胞融合技術(shù)使產(chǎn)生氨基酸的短桿菌雜交，獲得比原產(chǎn)量高3倍的賴氨酸產(chǎn)生菌和蘇氨酸高產(chǎn)新菌株。釀酒酵母和糖化酵母的種間雜交，分離子后代中個別菌株具有糖化和發(fā)酵的雙重能力。日本國稅廳釀造試驗所用該技術(shù)獲得了優(yōu)良的高性能謝利酵母來釀制西班牙謝利白葡萄酒獲得了成功。在基礎理論方面，研究外源DNA轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、基因定位、病毒傳遞以及核與核、核與質(zhì)之間的關(guān)系等已取得重大進展。
歐盟生物實驗室設備與維護集團（BiologicalLaboratoryEquipment, MaintenanceandServiceLtd.簡稱：BLS）,BLS公司是歐洲一家專業(yè)生產(chǎn)電融合設備的廠家，尤其在胚胎干細胞的電融合上面更具有全球****的技術(shù)。BLS細胞融合儀CF-150B和相關(guān)電極槽(GSS-250)專為哺乳動物胚胎分裂球電融合而設計，可在電解液或非電解液中運用。一個適當導向的短電脈沖施加在早期胚胎可以溶解細胞膜，從而完成細胞質(zhì)和細胞核融合。此細胞融合儀的主要應用是產(chǎn)生小鼠四倍體胚胎產(chǎn)生和體細胞核轉(zhuǎn)移克隆。
