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自發(fā)活動試驗方法學研究進展
日期：2024-12-27 11:20
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摘要：
自發(fā)活動試驗是一個**神經系統(tǒng)**藥理學評價及神經科學學科研究的常用方法，自發(fā)活動試驗已經發(fā)展成一類可對多種動物觀察多項自發(fā)活動分類行為指標，并為包括**神經系統(tǒng)**藥理學研究在內的多種藥理學研究目的提供參數的重要方法。近年來研制的新試驗裝置和發(fā)展的新方法具有較多優(yōu)點，本文簡要介紹近年來鼠、豬與猴自發(fā)活動試驗方法學研究若干進展。
關鍵詞 自發(fā)活動；開場試驗；**藥理學；藥理學方法
自發(fā)活動行為測定是一些神經科學學科研究動物的安寧、神經行為遺傳學及腦功能的重要參數，作為**神經系統(tǒng)臨床前觀察**行為作用和**藥理學評價的始初篩選一般包括行為和活動測定。活動行為監(jiān)測亦是觀察生存健康的主要生理指標及研究賓主共棲生物的影響和環(huán)境因子的一種手段。因此，活動行為監(jiān)測已經滲透到大多數嚙鼠類動物廣泛范圍的各項研究，并已擴大到對非人靈長類動物等的研究，無論作為主要關注點還是附加方法，已涉及研究靈長類的時間生物學、營養(yǎng)學、毒理學范疇。各種動物有其自身的自發(fā)活動類型，因而測量裝置應按動物特點設計。監(jiān)測動物行為活動的方法有紅外線光束、超聲波、視頻分析、電壓金屬板、運動傳感器、機械振動傳感測定、機械裝置、植入遙感勘測傳送裝置等定量活動行為方法。抖籠法、抖籠滴水法、轉輪法、斜籠法、運動計量法等以往的經典方法現已不常用。近年來研發(fā)的一批新裝置和發(fā)展了一批新方法具有較多優(yōu)點，本文簡要介紹近年來自發(fā)活動試驗方法學研究若干進展。
1 .小鼠自發(fā)活動試驗
小鼠自發(fā)活動試驗是應用*廣的自發(fā)活動行為測定方法，其中多數用紅外線光束法測定小鼠的自發(fā)活動總數，或用開場法人工或自動記錄穿越格數、后腿站立次數、理毛次數、大便粒數、豎起或修飾次數(兩前肢離地1cm以上的次數)、豎起或修飾時間(兩前肢離地1cm以上的時間)，但多數方法忽略呼吸、頭與尾動作及顫動等小的移動。近年采用計算機視頻跟蹤系統(tǒng)能監(jiān)測垂直與水平移動包括走動、
跳動和頭部活動。
1．1 VidiomexV圖象分析法
該系統(tǒng)測定開放場區(qū)的小鼠自發(fā)活動，給藥后將小鼠單只放入墊有黑色橡膠板的開放場(35 cm×30 cm×22cm)，適應環(huán)境10min，視頻圖象顯示和圖象分析儀均由電腦操作調控完成。圖象分析系統(tǒng)自動顯示和記錄自發(fā)活動10min，測定參數包括走動距離、行走時間、靜止時間和平均速度。作者用該法研究按Roth改良法給予15種不同處理組成的非預知性緊張性刺激復制的慢性應激小鼠與正常小鼠的自發(fā)活動，發(fā)現兩組參數無顯著差異。陽性對照藥抗抑郁藥地昔帕明l5II1g·kg能使應激小鼠的走動距離、行走時間和平均速度縮短，而靜止時間延長。提示地昔帕明對應激動物有**作用，而巴戟天低聚糖處理小鼠的自發(fā)活動無顯著變化，提示該藥無興奮或**作用。
1．2 嚙鼠試驗籠法
每個試驗籠(40 cm×25 cm×15 em)放于12 em厚墻內的隔音木箱中，低高二個紅外光束探頭置于離地2、8cm處，地面墊1cm厚鋸屑。
測量參數有：
① 走動，由低位探頭測量小鼠在試驗籠內的水平位走動；
②站起：由高位探頭記錄站起次數與站起所需時間的比例；
③活動總數：連續(xù)的接觸試驗籠的次數，即傳感器接受動物所致試驗籠的各種振動如走動、站起及搖動、震動、抓搔、修飾。測量時間為3個連續(xù)的20min。每鼠僅測1次活動參數。
用該法研究出生后10～12 d小鼠，開始給鐵劑7．5 mg·kg～，61d后同時加用安定藥氯氮平1或5mg·kg一，或安定藥氟**醇1 mg·kg一，連續(xù)3周，末次藥后24 h內測定自發(fā)活動，每只記錄60min，然后注射阿樸**1mg·kg 再記錄60 min。結果顯示：出生后給鐵劑可減少頭2個20分的活動，而末20min顯示活動增加。氯氮平5 lTlg·kg亞慢性給藥，可削弱或完全消除出生后給鐵所致頭2個20min活動減少，削減給鐵致末20min走動和活動總數增高，而對站起則無作用。氟**醇亞慢性給藥對出生后不加鐵者可增加頭20min的走動和第2個20min的站起數。氟**醇亞慢性給藥可消除出生后給鐵組頭2個20min的活動減少，也消除出生后鐵所致末20min的活動增加，作用大于高劑量氯氮平。出生后加鐵組給阿樸**后可增加走動和站起，而不增加活動總數。氯氮平1、5mg·kg亞慢性給藥降低出生后加鐵引起的走動增加，氯氮平5lTlg·kg進一步升高出生后給鐵引起的站起增加。氯氮平和氟**醇亞慢性給藥再給阿樸**可增加出生后賦形劑處理小鼠的走動，而氯氮平則增加站起數。該文這種給藥后分時間段測定自發(fā)活動數和添加工具藥的方法，有益于分析**影響自發(fā)活動的作用特點]。
2 .大鼠自發(fā)活動試驗
2．1 開場試驗
開場環(huán)境試驗所伴有的溫和緊張性刺激對動物是在一種新奇背景中的自發(fā)活動行為評價。動物在開場環(huán)境的活動是一種綜合行為，包含對新環(huán)境的恐懼、高度激勵和不斷地探查。因此，可因逃跑反應而增加活動或呆住反應而減少活動，其中包含恐懼或焦慮因素，由于動物情緒狀態(tài)的即時調節(jié)及其自體修飾、排便和排尿等行為和生理學反應而維持平衡。Weiss等_5報告了大鼠隔離飼養(yǎng)對開場試驗自發(fā)活動的影響。位于實驗室內的開放場由暗灰色塑料制成的4個正方形(76．5cm×76．5cm×49cm)區(qū)域組成，12勒克司弱光照明。視頻照相機固定于4個區(qū)域的上方并傳輸到監(jiān)控器和視頻跟蹤運動分析系統(tǒng)，記錄大鼠在整個場區(qū)的活動行為作為總行走距離(cm)，此外，在開場區(qū)設定一個虛擬的場區(qū)中心，大鼠在該區(qū)內的活動用作評價冒險行為。大鼠在試驗場內適應60min后稱體重，逐一放入開放場區(qū)中央進行試驗，在60min的試驗期內動物分組平均地進行。雄雌分別隔天進行活動計數10min，并分析試驗期間動物糞便存積數。大鼠分兩組，一組從21天齡起斷乳后每籠1鼠隔離飼養(yǎng)，另組每籠3～4鼠群居飼養(yǎng)。結果顯示，兩組動物能適應開放場環(huán)境，雌鼠的移動距離(1610．1±154．7cm)多于雄鼠(999．7±109．1cm)，但1 h內每10min測得的分段移動距離兩組均逐步減少。如同在整個場區(qū)的活動一樣兩組動物在中心區(qū)的活動也顯著地逐步減少，亦以雌鼠(184．7±33．7cm)高于雄鼠(59．2±12．3cm)。群居或隔離飼養(yǎng)不影響大鼠的自主活動。性別和群居隔離飼養(yǎng)對大鼠在整個場區(qū)或中央區(qū)內的移動距離均無相互作用。雌雄在開放場環(huán)境的排便量相似，群居隔離飼養(yǎng)及性別與群居隔離飼養(yǎng)間相互作用對排便無影響。
2．2 改良開場試驗
該試驗可結合觀察對刺激物的注意力，裝置的閉路視頻相機置于方形白色室壁開放場箱(60 cm×60 em×45cm)上方50cm處，所有信號由視頻跟蹤系統(tǒng)分析并收集于電腦，試驗時紅光照明以增強物體與背景的對比并減少動物的陰影。占場區(qū)1／9的中心區(qū)由電腦分析器單獨監(jiān)控。試驗開始前將4cm×4cm×2cm固體泡沫塑料塊作為刺激物用螺絲固定放于中心區(qū)的中心。大鼠不必離室壁移動很遠而容易地穿越中心區(qū)，這種設計的基本原理是創(chuàng)造一個環(huán)境使大鼠有低而可靠的可能性進入中心區(qū)而不管存在目標與否。為確證進入中心區(qū)與對刺激物的注意力有關，將動物頭部用記號筆涂黑，使相機僅跟蹤大鼠身體的該特征。10min試驗期間每2．5min由電腦收集資料一次，以評價參數的動態(tài)變化。行為測量包括總移動距離、進入中心區(qū)的次數、持續(xù)在中心區(qū)的時間、進入中心區(qū)平均所需時間(s／進入)。該研究用開放場試驗延伸分析動物對刺激目標的反應，而不引起活動增高的干擾，提供了一個動物對外界特殊刺激反應的行為指標，動物在試驗期間即使重復應用相同的刺激物亦不降低對目標的反應，表明新奇不是引起探究反應的重要因素。調節(jié)開放場大小、放刺激物區(qū)域的大小與位置、刺激物的大小與成分以及試驗期限能改變并擴充行為測量的內涵。如放置一個有氣味的目標食物，然后除去食物，量化動物對食物刺激目標的行為反應，可用在中心區(qū)的停留時間以評價食物刺激的不同功效和評價厭食藥的影響。同樣，與性別相關的有氣味刺激物也能用作評價**和藥理學變量對性別相關刺激反應的影響。表明該方法對種種行為背景潛在的適用性，結合定量跟蹤動物對特殊刺激目標的自發(fā)行為反應是行為神經科學一種有適用性的方法學。
2．3 計算機圖像法評價自發(fā)活動
嚙齒動物活動圖像自動識別裝置(the rodent activity patternidentifi．cationdevice，RAPID)由觀察環(huán)境、圖像獲取硬件和軟件、圖像分析和分類程序、資料分析程序等部件組成。觀察箱為一底長52．5cmX高23．5cm的梯形樹脂玻璃箱，分成兩個等大的小室，室間壁上有6個直徑1．2cm的小孑L，以使同步試驗的對照和處理大鼠彼此看見并聞到氣味，2個視頻探頭分別置于觀察箱上方與側面約1ITI處，可從2個方向觀察大鼠的任何復雜活動。觀察室白光照明，其大小的限制取決于視頻照相機的像素，256X256像素的分辨率將適合于評價大致的活動行為，如增加到512×512像素，則對小鼠或大鼠整體可仔細分辨，如足與尾巴的活動亦不會遺漏。該RAPID系統(tǒng)規(guī)定的動作分類盡可能接近于明確的行為動作、狀態(tài)、姿勢、面部表情、抗議和動作趨勢。包括5個主要身體姿勢和8種修飾動作，兩組13種動作相互關聯(lián)而又獨立，13個“單元動作”的雙元結合形成27個不同的組合動作。5個主要身體姿勢之一和8種修飾動作結合被定為一個組合動作類別，體位姿勢伴有修飾動作時的組合動作呈配對發(fā)生。
表1 RAPID行為動作分類法的行為動作操作說明
主要身體姿勢 說明
站立 大鼠四肢著地，身體不移動坐身體前半部抬起，身體前部和后部幾乎成直角，身體后部著地
站起 用后腿站起，身體趨于垂直，前部抬起
行走 大鼠四肢著地走動
躺下 身體腹部著地，不移動(至少需要5個畫面)
修飾類動作
空白 修飾不能識別
修飾 嘴和足底觸及身體
頭轉動 頭水平移動超過l5o
觀望 頭向上但不針對一個目標，身體不移動
聞 鼻子觀測籠壁的一個孑L
嗅 鼻子對著一個目標：地面或墻壁，身體不移動
轉動 頭和身體水平移動超過20~
洗臉 前蹄在頭部挪動
通過分析個體間的可變性、對照值的重現性和受試物處理效應的穩(wěn)定性考察實驗裝置的可靠性，發(fā)現RAPID系統(tǒng)行為動作的分類和3個經訓練的人工觀察者的分類相比，統(tǒng)計兩者的Kappa值有高度一致性。人工觀察和RAPID分類的修飾活動如嗅和聞彼此間亦有很好一性。評價2個獨立實驗室34只對照大鼠的變異系數，雖種系相同但并非無病原體，體重為2～3周齡，顯示主要身體姿勢動作的出現率大多數在25％～35％的范圍內。將D．***1mg·kg處理大鼠的反應重現性與文獻值比較，3名獨立測量者的資料有明顯一致性和重性，動物活動數、總活動時間和動作的時間分布和時間次序有高度相關性。該裝置采用自動控制可降低偏見和減少誤差，消除觀察者的可變性，使手續(xù)程序輕松快捷，且可長久記錄觀察資料。由于近來硬件成本顯著降低，且系統(tǒng)能觀察大量動物，同時從幾個視頻記錄器的終端得到資料，如設計15min同時觀察2只大鼠，3個終端每小時觀察6只大鼠，8h能觀察72對，并能保存和分析所有資料，因此十分經濟和高效 。
2．4 探測身體輻射熱法試驗
Supermex系統(tǒng)用傳感器探測動物身體輻射熱來測量活動行為，傳感器置于透明兩烯酸鼠籠上方，兩側有一對紅外熱電探測器即站起傳感器以測量動物站起的輻射熱，該系統(tǒng)可發(fā)現一個直徑6m和上方視野110。的圓錐形區(qū)域內溫度高于背景5℃的任何目標，每個傳感器探頭能監(jiān)測籠內多個區(qū)域動物在X、Y、Z軸的移動活動，適用于嚙齒類小動物或小型長尾猴到大動物犬、猴和豬等動物，操作非常簡便，靈敏度不需調節(jié)，傳感器可以固定置于鼠籠上方的天花板，一個Super．mex能任意選擇分析80個接口記錄的數據。一名操作者能同時監(jiān)控5只大鼠，自動匯總記錄15min所得計數。用該系統(tǒng)測試發(fā)現促甲狀腺素釋放**和垂體腺苷酸環(huán)化酶活化多肽腦室內給藥能劑量依賴地顯著增加自發(fā)活動，促甲狀腺素釋放**200或4OOnmol產生的活動總計數5000次，為對照的250％ ，垂體腺苷酸環(huán)化酶活化多肽1 mnol是對照的300％ ，2mnol的總計數9 000次為對照的750％，而2nmol血管活性腸肽改變自發(fā)活動計數不顯著。站起行為因**數明顯低于自發(fā)活動故有更大的差異性，上述肽類所致的站起行為改變類型類似于自發(fā)活動變化的類型。促甲狀腺素釋放**和垂體腺苷酸環(huán)化酶活化多肽能劑量依賴地顯著增加活動數，促甲狀腺素釋放**4OOnmol的站起數是對照的261％。垂體腺苷酸環(huán)化酶活化多肽1nmol增加站起數為對照的179％ ，2nmol增加數為對照的400％，血管活性腸肽2nmol不影響站起數。作者認為刺激自發(fā)活動可能是由于激活多巴胺能系統(tǒng)，而刺激站起行為可能是由于激活去甲。腎上腺素能系統(tǒng)。因此，自發(fā)活動行為是觀察**神經興奮劑對兒茶酚胺能系統(tǒng)效應的一個好指標。
3 .小型豬數字視頻跟蹤系統(tǒng)測定自發(fā)活動
3．1 測定方法
連接數字視頻記錄器的記錄豬自發(fā)活動的單色錄像機，能監(jiān)控整個場區(qū)(2m×3．15m)四角和每側墻壁的中央以獲取參數。7頭18月齡雌性小型豬于進入研究前適應環(huán)境6個月，用D．***處理5次以使動物有相似的興奮程度，末次給藥在6個月前完成。試驗開始前1周作3個30min的場區(qū)環(huán)境適應，測試10：O0～15：O0間的自發(fā)活動。每個d3做動物試驗，先給賦形劑0．9％NaCl 0．2ml，隨后以0.05、0．1、0．3mg·kg。。的遞增劑量3次im鹽酸阿樸**。注射后立即引入場內，靜置1h，然后視頻記錄自發(fā)活動60min。結果表明該法有很好的可重復性，試驗對每頭豬跟蹤10rain，7頭豬跟蹤兩次的平均移動距離是29．6±9．6m，平均誤差是0．10±0．02 m，可重復性系數0．6％，表明該方法有高的可重復性。
3．2 **性評價
為了評價基礎干擾水平對**性的影響，將一只大約與豬相同大小和顏色(淺米色)的箱子(30cm×47em)作為一個固定目標放在開放場并“跟蹤”10rain，用計算機從該箱記錄的移動距離估計計算方法的**性，結果顯示對該目標記錄的誤差僅一個像素，估計移動距離為2m。試驗10min內對照的平均移動距離為42 4-17 m，能增加豬活動的阿樸**0．05 mg·kg作陽性對照為157±46m，誤差大小與豬的總移動距離有關，約相當于移動距離預計誤差的1％ ～5％ ，表明該方法有很高的**性。
3．3 方法學評價
用轉盤法估計對移動目標跟蹤過程的**性，在距平均轉速0．02 m·s 的黑色圓盤(直徑34 cm)中心14cm處放一15lllln的白點，用跟蹤軟件估計的距離與白點移動的實際距離比較，白點準確移動二輪的計算值表示實際距離的百分比。結果表明，跟蹤轉盤上的移動白點的軌跡與跟蹤系統(tǒng)所記錄的實際軌道有很好的一致性。該點移動距離的實際計算值是176cm，而跟蹤軟件估計的移動距離是192cm,，跟蹤系統(tǒng)高估移動距離9％。這種偏差主要是由于偏離標準的像素大小。跟蹤系統(tǒng)識別該點是離轉盤中心的距離不是14cm而是15．2cm，這相當于移動距離191cm，非常接近于跟蹤運算得到的估計移動距離(192em)，因此跟蹤軟件在估計移動距離時的偏差主要來自鏡頭扭曲，引起像素大小偏離標準所致。該方法通過增強動物和背景間的對比，以提高跟蹤動物的**性，并克服了手工記錄容易疲勞、漏記及帶主觀性等缺點。并證明豬尾巴擺動不影響移動距離測量的**性。在可控條件下未發(fā)現豬在開放場的中心區(qū)與周邊區(qū)有任何區(qū)域空間偏愛，表明健康豬探測一個熟悉的區(qū)域無空間偏愛。而大鼠則不同于豬，有沿墻壁行走維持鼻毛與墻壁接觸的不對稱活動行為。
4 .小型長尾猴袖珍型活動掛表法模型
用于電腦遙控監(jiān)測飼養(yǎng)條件下猴行為活動的袖珍型活動掛表為帶有32kb內存包有圓柱形外套的壓電加速計，猴戴掛合適的活動掛表項圈后能很好耐受，約5min后便不再理睬。該裝置可以綜合各個方向動作的強度、數量和持續(xù)時間，能測出大于0．5g作用力的活動。實驗前24h將該裝置掛于動物的頸項，每天定時測定15min，連續(xù)14d。試驗分配對組8只猴(雄性切除輸精管)飼養(yǎng)于4只籠內與群居組8只單一性別猴飼養(yǎng)于有管道相連的二只籠內，地面上方1m處有400勒克斯照明，12h的明暗周期。該法的顯著優(yōu)點是可以實時非侵害性地監(jiān)測群聚在單個測試區(qū)域內的多只動物的自發(fā)活動，并便利地以*小干擾監(jiān)測動物在居籠內的一種關鍵行為指標，而不用改變動物生活環(huán)境。這種在居籠內的行為和生理學監(jiān)測，因為保持動物的平靜，而具有科學的正確性和實用性¨。。。
5 .結語
自發(fā)活動方法學研究的新進展表明，自發(fā)活動試驗已經發(fā)展成一類可對多種動物觀察多項自發(fā)活動分類行為指標，并為包括**神經系統(tǒng)**藥理學研究在內的多種藥理學研究目的提供參數的重要方法。多種多樣的自動化視頻跟蹤實驗儀器設備與**定量的測量指標已取代肉眼目測、手工記錄、裝置簡易與觀察指標不多的傳統(tǒng)方法。上述新近發(fā)展的自發(fā)活動試驗方法給我們帶來許多值得重視的啟示：實驗環(huán)境應適合動物習性，活動室所用建筑材料與色澤、活動區(qū)大小、環(huán)境隔音、光照強度、對環(huán)境的性別差異、觀察持續(xù)時間與間隔選擇等對不同的動物均應有不同的要求，否則可能會影響動物本能的自發(fā)活動的真實性。不同動物應觀察其自身特有的自發(fā)活動行為，如小鼠自發(fā)活動的方式有走動、前肢上舉、抓搔、洗臉、舐足、嗅聞、咬等，大鼠、豬、猴亦均有自身的自發(fā)活動特點及自發(fā)活動晝夜時辰與日間分布規(guī)律，因此應設計不同的觀察指標在不同的時間作觀察，并應盡可能在動物處于生理狀況下取得不受人為干擾的真實原始數據。分類測定自發(fā)活動行為的各個單元動作，可區(qū)分**作用的特點。分析**對自發(fā)活動試驗中走動、站起等不同指標的影響可以探討**作用的機理，有作者認為刺激自發(fā)活動總數可能是由于激活多巴胺能系統(tǒng)，而刺激站起行為可能是由于激活去甲腎上腺素能系統(tǒng)。因此，自發(fā)活動行為是觀察**神經興奮劑對兒茶酚胺能系統(tǒng)效應的一個好指標。
根據**特點在自發(fā)活動試驗中添加目標刺激物、氣味或性別特異性等目的刺激物，在觀察自發(fā)活動的同時觀察動物對這些刺激物的注意力，或許可以發(fā)現**新的藥理作用。藥理實驗方法學研究是藥理學的重要組成，研究方法的改進與**將會推動藥理學科的發(fā)展，因此也應該是藥理學者研究的重要內容，從本文簡述的自發(fā)活動試驗方法學研究若干進展，提示被認為十分簡單的自發(fā)活動試驗方法也是大有研究價值的，藥理實驗方法學研究應該成為藥理學工作者共同關注的藥理學分枝學科。
摘自＜中國臨床藥理學與**學＞
