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從小鼠胚胎中分離胚胎干細胞的方法
日期：2024-12-27 10:42
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摘要：
設備和試劑
--6厘米**培養(yǎng)皿
--6厘米**培養(yǎng)皿
--M2培養(yǎng)基+1毫克/毫升牛血清白蛋白（sigma）
--M16培養(yǎng)基+ 1毫克/毫升牛血清白蛋白（sigma）
--BLS胚胎聚集針（DN-10 或DN-09）
--M16培養(yǎng)基+ 1毫克/毫升牛血清白蛋白（sigma）
--BLS胚胎聚集針（DN-10 或DN-09）
--ES細胞單細胞懸液
--窄口移液管（處理細胞和胚胎）來自Pasteur移液管或其他合適的玻璃毛細管（移液管內徑的應? 100μm ）
--來自雌性促排卵的八細胞胚胎
-- Tyrode’s液，酸性（ sigma）
--CO2孵化器
--CO2孵化器
A：準備聚集穴
1.在**培養(yǎng)皿滴6 滴M16培養(yǎng)培養(yǎng)基+牛血清白蛋白，然后覆上石蠟油
1.在**培養(yǎng)皿滴6 滴M16培養(yǎng)培養(yǎng)基+牛血清白蛋白，然后覆上石蠟油
2. 胚胎聚集針（BLS DN-10或DN-09）通過石蠟油和培養(yǎng)基按壓塑料表面，在每滴下面制作出 12-16個低壓穴，胚胎聚集針（BLS DN-10或DN-09）需用酒精清洗
3.將培養(yǎng)基放置于孵化器內，用CO2預均衡培養(yǎng)基
B.ES細胞的制備
B.ES細胞的制備
1.將ES單細胞懸液放置在**培養(yǎng)皿中的ES細胞培養(yǎng)基中孵育1-2小時。在此期間，它們將會聚集成由5-10個細胞組成的細胞部落。
2．使用窄口移液管將ES細胞落（5-10個細胞）放入聚集穴內。
C.胚胎制備和聚集
1.從2.5天促排卵或自然交配的小鼠輸卵管提取八倍體胚胎并在M2培養(yǎng)基中沖洗。
1.從2.5天促排卵或自然交配的小鼠輸卵管提取八倍體胚胎并在M2培養(yǎng)基中沖洗。
2.用3滴M2培養(yǎng)基清洗胚胎
3.通過簡短的接觸酸性灌流液除去胚胎透明帶。用移液管在一滴酸Tyrode’s液上釋放10-20胚胎，保持胚胎懸浮在溶液中，直到透明帶溶解。注意不要讓胚胎落到液體的底部并接觸塑料，以免刺穿。
3.通過簡短的接觸酸性灌流液除去胚胎透明帶。用移液管在一滴酸Tyrode’s液上釋放10-20胚胎，保持胚胎懸浮在溶液中，直到透明帶溶解。注意不要讓胚胎落到液體的底部并接觸塑料，以免刺穿。
4.將胚胎轉移回M2培養(yǎng)基
5.通過四滴M16 + BSA培養(yǎng)基清洗胚胎。
6.在預先準備好的聚集穴中，將一個胚胎與每個胚胎細胞落接觸
5.通過四滴M16 + BSA培養(yǎng)基清洗胚胎。
6.在預先準備好的聚集穴中，將一個胚胎與每個胚胎細胞落接觸
7.將培養(yǎng)皿轉至孵化箱內，孵化一晚。
8.將壓縮的或早期空泡桑椹胚移植到受體**角
8.將壓縮的或早期空泡桑椹胚移植到受體**角
