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基因?qū)氲姆椒?/h1>
日期：2024-12-27 20:09
瀏覽次數(shù)：8426
摘要：
盡管在世界范圍內(nèi)基因?qū)氲膰L試相當(dāng)多，但迄今尚無很成熟的導(dǎo)入方法， 更難以定點(diǎn)整合。目前，基因?qū)氲姆椒ㄖ饕幸韵聨追N：
1．顯微注射法
該方法是借助顯微操作儀，將裝有目的基因的毛細(xì)管針插入受精卵的原核中，注入基因。世界上**只轉(zhuǎn)基因小鼠就是用這種方法獲得的。在小鼠，60～80％的早期胚胎經(jīng)顯微注射目的基因后仍能存活，10-30％的胚胎經(jīng)移植后能正常發(fā)育至分娩。在家畜上使用該技術(shù)的難度較大，其原因一方面是由于家畜所能提供的受精卵數(shù)目較少，而且難以把握早期胚胎的發(fā)育時(shí)序，另一方面，家畜受精卵的細(xì)胞質(zhì)中含有不少脂肪和色素等透光度低的顆粒，降低了原核的可見度，干擾了操作的**性。顯微注射導(dǎo)入基因是發(fā)展*早的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，目前仍然是使用*廣、效率*高的方法。
2．逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法
該方法是將目的基因整合到逆轉(zhuǎn)錄病毒的原病毒基因組中，然后將原病毒注入早期胚胎，或是給動(dòng)物的培養(yǎng)細(xì)胞接毒后與胚胎一起培養(yǎng)，使病毒感染胚胎。Harvey(1990)用貓白血病毒作為載體，成功地將外源基因?qū)胙虻幕蚪M中并得到表達(dá)。該方法已被廣泛地應(yīng)用于基因表達(dá)機(jī)制、基因產(chǎn)物、細(xì)胞缺陷癥和人類遺傳病**等研究領(lǐng)域，具有整合的外源基因一般可自行復(fù)制，無須復(fù)雜的顯微操作等優(yōu)點(diǎn)，但整合成功率和基因表達(dá)率低，效果不穩(wěn)定。
3．胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法
這一方法的理論依據(jù)在于囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)含有尚未分化的胚胎干細(xì)胞，將這些干細(xì)胞植入正常發(fā)育的囊胚腔之后，很快便與受體內(nèi)細(xì)胞團(tuán)聚集在一起，參與正常胚胎的發(fā)育。用電穿孔或磷酸鈣沉淀法，將外源DNA轉(zhuǎn)移到胚胎干細(xì)胞中，或用逆轉(zhuǎn)錄病毒做為載體感染胚胎干細(xì)胞，然后篩選整合陽性的部分并將之植入受體囊胚腔。由此發(fā)育成的個(gè)體其染色體中可能整合了外源基因。經(jīng)胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物均屬嵌合體。
4．精子載體法
將外源基因片段與獲能精子一起孵育，然后，用攜帶有目的基因的精子進(jìn)行人工授精。此方法*大的優(yōu)點(diǎn)在于不需要昂貴復(fù)雜的設(shè)備，而且可以省略不少繁雜的操作。*近Rottman等將外源DNA用脂質(zhì)包埋后，與兔精子共同孵育，然后進(jìn)行人工授精，得到的49只仔兔，經(jīng)Southern和PCR分析，其中31只為基因整合陽性，陽性率為63.3％。Squires和Drake應(yīng)用同樣的方法在雞上獲得成功，陽性率為15.25％。我國(guó)新疆在奶牛上也有成功報(bào)道。但不少研究人員，用精子作載體進(jìn)行復(fù)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)未獲得陽性結(jié)果，而對(duì)這種方法持否定態(tài)度。
日期：2024-12-27 20:09
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摘要：
盡管在世界范圍內(nèi)基因?qū)氲膰L試相當(dāng)多，但迄今尚無很成熟的導(dǎo)入方法， 更難以定點(diǎn)整合。目前，基因?qū)氲姆椒ㄖ饕幸韵聨追N：
1．顯微注射法
該方法是借助顯微操作儀，將裝有目的基因的毛細(xì)管針插入受精卵的原核中，注入基因。世界上**只轉(zhuǎn)基因小鼠就是用這種方法獲得的。在小鼠，60～80％的早期胚胎經(jīng)顯微注射目的基因后仍能存活，10-30％的胚胎經(jīng)移植后能正常發(fā)育至分娩。在家畜上使用該技術(shù)的難度較大，其原因一方面是由于家畜所能提供的受精卵數(shù)目較少，而且難以把握早期胚胎的發(fā)育時(shí)序，另一方面，家畜受精卵的細(xì)胞質(zhì)中含有不少脂肪和色素等透光度低的顆粒，降低了原核的可見度，干擾了操作的**性。顯微注射導(dǎo)入基因是發(fā)展*早的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，目前仍然是使用*廣、效率*高的方法。
2．逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法
該方法是將目的基因整合到逆轉(zhuǎn)錄病毒的原病毒基因組中，然后將原病毒注入早期胚胎，或是給動(dòng)物的培養(yǎng)細(xì)胞接毒后與胚胎一起培養(yǎng)，使病毒感染胚胎。Harvey(1990)用貓白血病毒作為載體，成功地將外源基因?qū)胙虻幕蚪M中并得到表達(dá)。該方法已被廣泛地應(yīng)用于基因表達(dá)機(jī)制、基因產(chǎn)物、細(xì)胞缺陷癥和人類遺傳病**等研究領(lǐng)域，具有整合的外源基因一般可自行復(fù)制，無須復(fù)雜的顯微操作等優(yōu)點(diǎn)，但整合成功率和基因表達(dá)率低，效果不穩(wěn)定。
3．胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法
這一方法的理論依據(jù)在于囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)含有尚未分化的胚胎干細(xì)胞，將這些干細(xì)胞植入正常發(fā)育的囊胚腔之后，很快便與受體內(nèi)細(xì)胞團(tuán)聚集在一起，參與正常胚胎的發(fā)育。用電穿孔或磷酸鈣沉淀法，將外源DNA轉(zhuǎn)移到胚胎干細(xì)胞中，或用逆轉(zhuǎn)錄病毒做為載體感染胚胎干細(xì)胞，然后篩選整合陽性的部分并將之植入受體囊胚腔。由此發(fā)育成的個(gè)體其染色體中可能整合了外源基因。經(jīng)胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物均屬嵌合體。
4．精子載體法
將外源基因片段與獲能精子一起孵育，然后，用攜帶有目的基因的精子進(jìn)行人工授精。此方法*大的優(yōu)點(diǎn)在于不需要昂貴復(fù)雜的設(shè)備，而且可以省略不少繁雜的操作。*近Rottman等將外源DNA用脂質(zhì)包埋后，與兔精子共同孵育，然后進(jìn)行人工授精，得到的49只仔兔，經(jīng)Southern和PCR分析，其中31只為基因整合陽性，陽性率為63.3％。Squires和Drake應(yīng)用同樣的方法在雞上獲得成功，陽性率為15.25％。我國(guó)新疆在奶牛上也有成功報(bào)道。但不少研究人員，用精子作載體進(jìn)行復(fù)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)未獲得陽性結(jié)果，而對(duì)這種方法持否定態(tài)度。
