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活體電穿孔法原理、特點和應(yīng)用
日期：2025-01-09 14:45
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摘要：1、什么是活體電穿孔
活體電穿孔法(in vivo electroporation) 是將外源基因通過電場作用，導(dǎo)入動物目標(biāo)組織或器官。由于這種方法能有效導(dǎo)入外源基因，可在多種組織器官上應(yīng)用，并且效率較高?；铙w電穿孔法的原理很簡 單，在直流電場作用的瞬間，細(xì)胞膜表面產(chǎn)生疏水或親水的微小通道105～115μm ，這種通道能維持幾毫秒到幾秒，然后自行恢復(fù)。在此期間生物大分子如DNA 可通過這種微小的通道進(jìn)入細(xì)胞。近年來活體電穿孔法用于轉(zhuǎn)基因研究的報道不斷增多，在基因**方面的優(yōu)勢也日趨顯著，是一種很好的活體基因?qū)敕椒ā?
活體電穿孔法...
1、什么是活體電穿孔
活體電穿孔法(in vivo electroporation) 是將外源基因通過電場作用，導(dǎo)入動物目標(biāo)組織或器官。由于這種方法能有效導(dǎo)入外源基因，可在多種組織器官上應(yīng)用，并且效率較高?；铙w電穿孔法的原理很簡 單，在直流電場作用的瞬間，細(xì)胞膜表面產(chǎn)生疏水或親水的微小通道105～115μm ，這種通道能維持幾毫秒到幾秒，然后自行恢復(fù)。在此期間生物大分子如DNA 可通過這種微小的通道進(jìn)入細(xì)胞。近年來活體電穿孔法用于轉(zhuǎn)基因研究的報道不斷增多，在基因**方面的優(yōu)勢也日趨顯著，是一種很好的活體基因?qū)敕椒ā?/span>
活體電穿孔法可用于檢測瞬時表達(dá)系統(tǒng)中載體的表達(dá)狀況。大量的研究表明活體電穿孔法在基因**方面有非常好的應(yīng)用前景。因此目前國內(nèi)外對活體電穿孔法介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移的研究越來越多。
2、活體電穿孔的法的特點
活體電穿孔法基因?qū)牒捅磉_(dá)效率較高，它的特點主要在以下幾個方面:
首先，靶器官的選擇面廣，理論上任何組織和器官都可以作為活體電穿孔的靶器官。
在用于基因**方面，要考慮到靶器官組織生理特性。如果所選擇的局部組織細(xì)胞不能把所轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)產(chǎn)物分泌到外周血液循環(huán)中，則在某種意義上說已失去了 基因?qū)氲膬r值，這在基因**中是關(guān)鍵性的問題。當(dāng)使用組織特異性表達(dá)載體時，研究人員應(yīng)根據(jù)所構(gòu)建的表達(dá)載體來選擇基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的靶器官組織。例如魚 精蛋白21 啟動子可指導(dǎo)外源基因在精母細(xì)胞中特異性表達(dá)，以小鼠的睪丸作為靶器官將含有魚精蛋白21啟動子的表達(dá)載體導(dǎo)入，獲得外源基因的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于該基因在肝 臟和骨骼肌中的表達(dá)。
其次，對導(dǎo)入的外源基因片段的大小沒有限制，從幾KB 或十幾KB 的表達(dá)載體， 到100～200KB 的YAC、BAC基因組 ，都有成功導(dǎo)入并獲得表達(dá)的報道。
此外活體電穿孔法操作簡單快速，電穿孔的時間只有幾秒鐘，而且DNA片段不需要特殊的純化操作。
但電穿孔法也存在一些的缺點:首先，外源基因表達(dá)持續(xù)的時間很短，雖然外源基因?qū)牒?快可在215 小時有表達(dá)，但大多1～2 月后表達(dá)量降至很低。外源基因表達(dá)的時間主要由于所構(gòu)建的表達(dá)載體和基因?qū)氲陌屑?xì)胞組織器官不同而存在巨大差異。
由于應(yīng)用不同的表達(dá)載體，Muramatsu 在小鼠肝臟進(jìn)行電穿孔7天后則檢測不到外源基因的表達(dá)，而Heller 21 天后還可以檢測到外源基因的表達(dá)。如果選擇代謝和酶活動旺盛的組織器官如肝臟，則表達(dá)持續(xù)時間會較短，表達(dá)時間在1 個月以內(nèi)，但以骨骼肌為靶組織，表達(dá)可持續(xù)15個月。
3、 活體電穿孔法與其他活體基因?qū)敕椒ǖ谋容^
到目前為止，非病毒載體的活體基因?qū)敕椒ㄓ兄苯幼⑸浞?、脂質(zhì)體法、基因槍法、電穿孔法等。每一種方法都有其各自的特殊性，因此很難將這幾種方法進(jìn)行簡單的比較。
直接注射法：可將外源基因直接注射到靶位點或血管中，但此種方法不適合以肌肉作為靶器官，它的外源基因表達(dá)效率極低，僅為電穿孔法的百分之一。
脂質(zhì)體法：活體基因轉(zhuǎn)移法中脂質(zhì)體法更適宜較大面積組織的基因?qū)?，但無法避免DNA濃度變低，在出血的情況下會使本來不高的DNA濃度更加降低，往往造成基因?qū)胄实汀?/span>
基因槍法：適合于DNA較易接觸到的質(zhì)地較堅韌的組織如皮膚，而視網(wǎng)膜、胚胎和禽類的胚盤等組織會由于機械刺激和出血造成器質(zhì)性損傷或發(fā)育停滯，因而不能 用基因槍法完成。DNA包裹的金屬顆粒從基因槍發(fā)出到達(dá)組織表面大多只幾百微米的距離，較深層的組織不易操作， 表達(dá)效率也較低。
Muramatsu報道在材料一致的情況下，電穿孔法的基因?qū)牒捅磉_(dá)效率明顯高于其它方法，而且電穿孔法適合多種組織的操作[3 ] 。
4 、活體電穿孔法施加條件的研究
波型的選擇
在電穿孔過程中方波較指數(shù)衰減波更能獲得較高的基因表達(dá)。同時方波只要要求控制電壓和時間，十分直觀，而指數(shù)衰減波需要控制的電壓、電容、電阻等參數(shù)，這樣的條件摸索過程中，方波較指數(shù)衰減波更易得到高表達(dá)。
電 壓
電穿孔時在能量導(dǎo)入一定的情況下設(shè)計施加電壓的值。電壓過低或過高都會影響外源基因的表達(dá)。電壓過低時，無法造成細(xì)胞膜表面狀態(tài)的改變，因而外源D 不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。電壓過高時，局部組織積聚過多熱量，造成細(xì)胞的死亡或組織失去功能，即使外源基因?qū)爰?xì)胞，也無法進(jìn)行正常的表達(dá)。哺乳動物常用的活體電 壓大多為20～100VPcm ，*高電壓在250～750VPcm。
電穿孔次數(shù)和時間
有試驗證明，皮膚的電阻在每一次電穿孔后都有所降低，說明電穿孔使皮下組織形成孔道，且其大小隨電穿孔而變大，經(jīng)過電穿孔的處理后外源基因更易在更深的真皮和毛囊內(nèi)表達(dá)。但電穿孔次數(shù)不能過多，否則會對局部的細(xì)胞組織造成不可逆的損害，基本應(yīng)在10 次以內(nèi)，
每組電穿孔時間應(yīng)在20～100msec 。
能量的測算
電穿孔過程中能量的測算公式為: Q(J ) = V2 TP412R 其中Q 代表電穿孔時導(dǎo)入的能量，V 代表施加的電壓，T 代表電穿孔延續(xù)的時間，R 代表作用組織的電阻。試驗證明在導(dǎo)入能量一定的情況下外源基因轉(zhuǎn)移效率也相近。在此原則基礎(chǔ)上可根據(jù)不同的組織器官選擇不同的電壓和電穿孔時間。
溫 度
由于電穿孔瞬間在局部會產(chǎn)生大量熱，因此操作過程中，DNA 轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)保持4 ℃，同時電穿孔操作部位的溫度也應(yīng)適當(dāng)降低，Muramatsu 證明溫度較低的情況下，外源基因的轉(zhuǎn)移表達(dá)效率會有明顯的提高。此外在電穿孔操作部位溫度降低的同時可以有效抑制局部組織的出血和外源DNA 的流失，這樣也在一定程度上保證了基因的導(dǎo)入效率。
DNA 的狀態(tài)和濃度
很多試驗都證明線狀DNA 較環(huán)狀DNA 在活體電穿孔法瞬時表達(dá)系統(tǒng)的建立中效果較好[12 ] 。DNA 的濃度應(yīng)在1～40mgPml 范圍內(nèi)。
DNA 溶液組分
DNA溶液中不應(yīng)含有不能分解成離子的組分，如甘露糖醇、蔗糖等。這些大分子存在時會降低基因的轉(zhuǎn)移效率。
5、活體電穿孔法在不同組織上的應(yīng)用
肌肉組織
在肌肉組織中*初進(jìn)行外源基因活體導(dǎo)入是采用電穿孔法。選擇肌肉組織作為靶組織是因為肌肉組織在體內(nèi)所占比例很大，約占40 % ，而且外源基因可在肌肉中長期表達(dá)、分泌，在基因**中經(jīng)常會用到。此外，外源基因也不會因肌細(xì)胞的分裂而丟失。
皮 膚
皮膚組織相對于其他組織較難進(jìn)行電穿孔法的基因?qū)耄驗槠つw比較薄，電阻相對低，要求電流較高。但如果電流過大，會嚴(yán)重影響基因的表達(dá)，因此應(yīng)適當(dāng)降低 電流和電壓，延長電穿孔的時間。另外，由于皮膚組織含有的脂肪細(xì)胞分布不均，會干擾電穿孔的作用，因此只推薦用鑷狀電極，且應(yīng)將動物被毛刮凈后操作。雖然 外源基因在皮膚中表達(dá)的時間較肌肉中短，但可利用活體電穿孔法對很多皮膚**進(jìn)行**。
肝 臟
由于肝臟的生理代謝十分旺盛，因此外源基因在肝臟中的表達(dá)時間往往很短暫，而且表達(dá)產(chǎn)物的水平也較低。為減少出血，可從小靜脈注入，然后在肝臟上施加電場，能顯著增強基因的表達(dá)。
睪 丸
相對于其他的轉(zhuǎn)基因方法，活體電穿孔法可使外源基因在睪丸中產(chǎn)生大量和持久的表達(dá)。此外，很多研究人員希望利用活體電穿孔法將外源基因?qū)刖樱?進(jìn)而通過授精得到轉(zhuǎn)基因動物。Yamazaki 等[13 ] 和Ryoki 等[14 ] 用甲磺酸丁二醇二酯注射或用手術(shù)法將動物人為造成隱睪，大部分體細(xì)胞和分化了的精母細(xì)胞減少，這樣使外源基因?qū)刖?xì)胞的幾率增加。Ryoki 等[14 ] 將基因與病毒誘導(dǎo)的整合酶基因共轉(zhuǎn)染，可在精原細(xì)胞中檢測到外源基因的表達(dá)，且病毒誘導(dǎo)的雙基因共轉(zhuǎn)染較單基因整合效率更高。但目前用這種方法獲得轉(zhuǎn)基因 動物還較難。
禽類輸卵管
對禽類輸卵管活體電穿孔的研究很少，但這一方法卻有很廣闊的發(fā)展前景。因為輸卵管腺體細(xì)胞具有很強的分泌功能，可以將大量蛋白分泌到雞蛋中。也可以利用此 瞬時表達(dá)系統(tǒng)檢測含卵清蛋白啟動子的載體功能。Park 等用活體電穿孔法以熒光素基因?qū)腚u輸卵管上皮，檢測到熒光素活性約4500RLUPmg 組織[15 ] 。
眼睛、胚胎和禽類胚盤
這三種組織都是很脆弱的，如果實施基因槍法，會使靶組織因強烈的機械損傷而失去功能或直接導(dǎo)致發(fā)育停滯。Sakamoto 將血纖蛋白溶酶原激活因子基因?qū)胙劬χ?，有效抑制了眼睛在淤傷后血纖蛋白的反應(yīng)。哺乳動物胚胎的電穿孔操作包括離體和**內(nèi)操作。禽類胚胎基本是在蛋殼 中進(jìn)行電穿孔的，而且表達(dá)快速，Momose 等報道電穿孔施加后215 小時在雞胚中就可以檢測到外源基因的表達(dá)，這在使用病毒載體時也是不可能的。當(dāng)電場被限定在一個很小的范圍內(nèi)時，基因可以定點表達(dá)， 這是活體電穿孔法的又一優(yōu)點，Katahira 等[17 ] 證實可將外源基因?qū)腚u胚大腦、心臟和一些微小組織(如中胚層，間充質(zhì)和體節(jié)) 中進(jìn)行表達(dá)。
6、 活體電穿孔法進(jìn)行基因**及外源基因表達(dá)的調(diào)控
6．1 活體電穿孔法在基因**方面的應(yīng)用
原來在基因**中利用活體電穿孔法將抗體或化療**導(dǎo)入腫瘤中，促進(jìn)抗體和化療**的運送來進(jìn)行**，現(xiàn)在則以特異的外源基因替代了抗體的應(yīng)用，簡化操作步驟同時降低了費用。
首先，在皮膚瘤和腦瘤的**中，電穿孔法可有效地將**基因?qū)?*部位。電穿孔法導(dǎo)入人單核細(xì)胞趨化物蛋白基因到大鼠腦瘤后，該蛋白在腫瘤的局部表達(dá)，同時在基因?qū)氲牟课豢捎^察到巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的聚集。
同時有科學(xué)家從另一角度研究電穿孔對**腫瘤方面的作用，利用高電場強度的陡脈沖促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生不可逆性電擊穿而*終死亡，這種方法很適于局部組織腫瘤的**。
此外，活體電穿孔法還可以參與癌癥的**，通過活體電穿孔法將基因?qū)霗C體后，導(dǎo)入組織可成為分泌抗體等物質(zhì)的臨時分泌器官，以抵**細(xì)胞的侵蝕或代償由于癌細(xì)胞的侵蝕而造成的機體多種生理機能的喪失。
除了可以利用活體電穿孔法對腫瘤進(jìn)行局部**外，還可以**機體的***系統(tǒng)和**系統(tǒng)的**?？稍跈C體局部以活體電穿孔法導(dǎo)入編碼分泌型蛋白的基因，這 種重組的**蛋白可以隨著血液循環(huán)分布到全身各種組織和細(xì)胞進(jìn)行**。如在活體電穿孔骨骼肌導(dǎo)入EPO 基因后，可通過紅細(xì)胞比容值檢測到EPO 基因表達(dá)產(chǎn)物的增加。Yasui 等在小鼠體內(nèi)檢測到活體電穿孔法導(dǎo)入的胃泌素基因的表達(dá)產(chǎn)物和人的單克隆抗體。
在不遠(yuǎn)的將來，研究人員可以選擇機體的一種組織的某個位置作為活體電穿孔的靶位點，將**基因從該位點導(dǎo)入進(jìn)而表達(dá)，因此又可以把這個特殊的組織當(dāng)作機體 的一個人造的***或**組織，對病人進(jìn)行相應(yīng)的**?；铙w電穿孔法可對系統(tǒng)**產(chǎn)生作用并且**有效。將不同類型的耐藥基因同時導(dǎo)入造血細(xì)胞，以擴大耐 藥范圍和進(jìn)行體內(nèi)選擇是基因**的重要策略，這類載體基因片段大多較長，進(jìn)行傳統(tǒng)基因?qū)胗幸欢ǖ碾y度。有報道可以用活體電穿孔法將醛脫氫酶基因和多藥耐 藥基因共轉(zhuǎn)移并在PA317 細(xì)胞中獲得高效表達(dá)，轉(zhuǎn)導(dǎo)率達(dá)98 % ，測定**蛋白表達(dá)較常規(guī)方法增高4 倍。此外電穿孔法有很高的經(jīng)皮促滲作用，可進(jìn)行很多經(jīng)皮給藥的**。
6．2 基因**中外源基因表達(dá)的調(diào)控
研究人員大都不希望導(dǎo)入的外源基因過度表達(dá)，尤其在基因**中，我們希望外源基因表達(dá)的誘導(dǎo)和抑制能夠得到控制。目前這方面的研究主要包括兩個方面:效應(yīng) 元件調(diào)節(jié)和生理活動調(diào)節(jié)。效應(yīng)元件的作用，例如類固醇類**誘導(dǎo)的效應(yīng)元件中，在卵清蛋白啟動子5′遠(yuǎn)端019kb 處有一個雌**效應(yīng)元件，將具有此元件的基因?qū)氤赡昴鸽u后，在其皮下注射糖皮質(zhì)**和雌**，便可誘導(dǎo)外源基因的高效表達(dá)，表達(dá)量較未經(jīng)**誘導(dǎo)的對照 組增加10 倍。
活體電穿孔法(in vivo electroporation) 是將外源基因通過電場作用，導(dǎo)入動物目標(biāo)組織或器官。由于這種方法能有效導(dǎo)入外源基因，可在多種組織器官上應(yīng)用，并且效率較高?；铙w電穿孔法的原理很簡 單，在直流電場作用的瞬間，細(xì)胞膜表面產(chǎn)生疏水或親水的微小通道105～115μm ，這種通道能維持幾毫秒到幾秒，然后自行恢復(fù)。在此期間生物大分子如DNA 可通過這種微小的通道進(jìn)入細(xì)胞。近年來活體電穿孔法用于轉(zhuǎn)基因研究的報道不斷增多，在基因**方面的優(yōu)勢也日趨顯著，是一種很好的活體基因?qū)敕椒ā?/span>
活體電穿孔法可用于檢測瞬時表達(dá)系統(tǒng)中載體的表達(dá)狀況。大量的研究表明活體電穿孔法在基因**方面有非常好的應(yīng)用前景。因此目前國內(nèi)外對活體電穿孔法介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移的研究越來越多。
2、活體電穿孔的法的特點
活體電穿孔法基因?qū)牒捅磉_(dá)效率較高，它的特點主要在以下幾個方面:
首先，靶器官的選擇面廣，理論上任何組織和器官都可以作為活體電穿孔的靶器官。
在用于基因**方面，要考慮到靶器官組織生理特性。如果所選擇的局部組織細(xì)胞不能把所轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)產(chǎn)物分泌到外周血液循環(huán)中，則在某種意義上說已失去了 基因?qū)氲膬r值，這在基因**中是關(guān)鍵性的問題。當(dāng)使用組織特異性表達(dá)載體時，研究人員應(yīng)根據(jù)所構(gòu)建的表達(dá)載體來選擇基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的靶器官組織。例如魚 精蛋白21 啟動子可指導(dǎo)外源基因在精母細(xì)胞中特異性表達(dá)，以小鼠的睪丸作為靶器官將含有魚精蛋白21啟動子的表達(dá)載體導(dǎo)入，獲得外源基因的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于該基因在肝 臟和骨骼肌中的表達(dá)。
其次，對導(dǎo)入的外源基因片段的大小沒有限制，從幾KB 或十幾KB 的表達(dá)載體， 到100～200KB 的YAC、BAC基因組 ，都有成功導(dǎo)入并獲得表達(dá)的報道。
此外活體電穿孔法操作簡單快速，電穿孔的時間只有幾秒鐘，而且DNA片段不需要特殊的純化操作。
但電穿孔法也存在一些的缺點:首先，外源基因表達(dá)持續(xù)的時間很短，雖然外源基因?qū)牒?快可在215 小時有表達(dá)，但大多1～2 月后表達(dá)量降至很低。外源基因表達(dá)的時間主要由于所構(gòu)建的表達(dá)載體和基因?qū)氲陌屑?xì)胞組織器官不同而存在巨大差異。
由于應(yīng)用不同的表達(dá)載體，Muramatsu 在小鼠肝臟進(jìn)行電穿孔7天后則檢測不到外源基因的表達(dá)，而Heller 21 天后還可以檢測到外源基因的表達(dá)。如果選擇代謝和酶活動旺盛的組織器官如肝臟，則表達(dá)持續(xù)時間會較短，表達(dá)時間在1 個月以內(nèi)，但以骨骼肌為靶組織，表達(dá)可持續(xù)15個月。
3、 活體電穿孔法與其他活體基因?qū)敕椒ǖ谋容^
到目前為止，非病毒載體的活體基因?qū)敕椒ㄓ兄苯幼⑸浞?、脂質(zhì)體法、基因槍法、電穿孔法等。每一種方法都有其各自的特殊性，因此很難將這幾種方法進(jìn)行簡單的比較。
直接注射法：可將外源基因直接注射到靶位點或血管中，但此種方法不適合以肌肉作為靶器官，它的外源基因表達(dá)效率極低，僅為電穿孔法的百分之一。
脂質(zhì)體法：活體基因轉(zhuǎn)移法中脂質(zhì)體法更適宜較大面積組織的基因?qū)?，但無法避免DNA濃度變低，在出血的情況下會使本來不高的DNA濃度更加降低，往往造成基因?qū)胄实汀?/span>
基因槍法：適合于DNA較易接觸到的質(zhì)地較堅韌的組織如皮膚，而視網(wǎng)膜、胚胎和禽類的胚盤等組織會由于機械刺激和出血造成器質(zhì)性損傷或發(fā)育停滯，因而不能 用基因槍法完成。DNA包裹的金屬顆粒從基因槍發(fā)出到達(dá)組織表面大多只幾百微米的距離，較深層的組織不易操作， 表達(dá)效率也較低。
Muramatsu報道在材料一致的情況下，電穿孔法的基因?qū)牒捅磉_(dá)效率明顯高于其它方法，而且電穿孔法適合多種組織的操作[3 ] 。
4 、活體電穿孔法施加條件的研究
波型的選擇
在電穿孔過程中方波較指數(shù)衰減波更能獲得較高的基因表達(dá)。同時方波只要要求控制電壓和時間，十分直觀，而指數(shù)衰減波需要控制的電壓、電容、電阻等參數(shù)，這樣的條件摸索過程中，方波較指數(shù)衰減波更易得到高表達(dá)。
電 壓
電穿孔時在能量導(dǎo)入一定的情況下設(shè)計施加電壓的值。電壓過低或過高都會影響外源基因的表達(dá)。電壓過低時，無法造成細(xì)胞膜表面狀態(tài)的改變，因而外源D 不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。電壓過高時，局部組織積聚過多熱量，造成細(xì)胞的死亡或組織失去功能，即使外源基因?qū)爰?xì)胞，也無法進(jìn)行正常的表達(dá)。哺乳動物常用的活體電 壓大多為20～100VPcm ，*高電壓在250～750VPcm。
電穿孔次數(shù)和時間
有試驗證明，皮膚的電阻在每一次電穿孔后都有所降低，說明電穿孔使皮下組織形成孔道，且其大小隨電穿孔而變大，經(jīng)過電穿孔的處理后外源基因更易在更深的真皮和毛囊內(nèi)表達(dá)。但電穿孔次數(shù)不能過多，否則會對局部的細(xì)胞組織造成不可逆的損害，基本應(yīng)在10 次以內(nèi)，
每組電穿孔時間應(yīng)在20～100msec 。
能量的測算
電穿孔過程中能量的測算公式為: Q(J ) = V2 TP412R 其中Q 代表電穿孔時導(dǎo)入的能量，V 代表施加的電壓，T 代表電穿孔延續(xù)的時間，R 代表作用組織的電阻。試驗證明在導(dǎo)入能量一定的情況下外源基因轉(zhuǎn)移效率也相近。在此原則基礎(chǔ)上可根據(jù)不同的組織器官選擇不同的電壓和電穿孔時間。
溫 度
由于電穿孔瞬間在局部會產(chǎn)生大量熱，因此操作過程中，DNA 轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)保持4 ℃，同時電穿孔操作部位的溫度也應(yīng)適當(dāng)降低，Muramatsu 證明溫度較低的情況下，外源基因的轉(zhuǎn)移表達(dá)效率會有明顯的提高。此外在電穿孔操作部位溫度降低的同時可以有效抑制局部組織的出血和外源DNA 的流失，這樣也在一定程度上保證了基因的導(dǎo)入效率。
DNA 的狀態(tài)和濃度
很多試驗都證明線狀DNA 較環(huán)狀DNA 在活體電穿孔法瞬時表達(dá)系統(tǒng)的建立中效果較好[12 ] 。DNA 的濃度應(yīng)在1～40mgPml 范圍內(nèi)。
DNA 溶液組分
DNA溶液中不應(yīng)含有不能分解成離子的組分，如甘露糖醇、蔗糖等。這些大分子存在時會降低基因的轉(zhuǎn)移效率。
5、活體電穿孔法在不同組織上的應(yīng)用
肌肉組織
在肌肉組織中*初進(jìn)行外源基因活體導(dǎo)入是采用電穿孔法。選擇肌肉組織作為靶組織是因為肌肉組織在體內(nèi)所占比例很大，約占40 % ，而且外源基因可在肌肉中長期表達(dá)、分泌，在基因**中經(jīng)常會用到。此外，外源基因也不會因肌細(xì)胞的分裂而丟失。
皮 膚
皮膚組織相對于其他組織較難進(jìn)行電穿孔法的基因?qū)耄驗槠つw比較薄，電阻相對低，要求電流較高。但如果電流過大，會嚴(yán)重影響基因的表達(dá)，因此應(yīng)適當(dāng)降低 電流和電壓，延長電穿孔的時間。另外，由于皮膚組織含有的脂肪細(xì)胞分布不均，會干擾電穿孔的作用，因此只推薦用鑷狀電極，且應(yīng)將動物被毛刮凈后操作。雖然 外源基因在皮膚中表達(dá)的時間較肌肉中短，但可利用活體電穿孔法對很多皮膚**進(jìn)行**。
肝 臟
由于肝臟的生理代謝十分旺盛，因此外源基因在肝臟中的表達(dá)時間往往很短暫，而且表達(dá)產(chǎn)物的水平也較低。為減少出血，可從小靜脈注入，然后在肝臟上施加電場，能顯著增強基因的表達(dá)。
睪 丸
相對于其他的轉(zhuǎn)基因方法，活體電穿孔法可使外源基因在睪丸中產(chǎn)生大量和持久的表達(dá)。此外，很多研究人員希望利用活體電穿孔法將外源基因?qū)刖樱?進(jìn)而通過授精得到轉(zhuǎn)基因動物。Yamazaki 等[13 ] 和Ryoki 等[14 ] 用甲磺酸丁二醇二酯注射或用手術(shù)法將動物人為造成隱睪，大部分體細(xì)胞和分化了的精母細(xì)胞減少，這樣使外源基因?qū)刖?xì)胞的幾率增加。Ryoki 等[14 ] 將基因與病毒誘導(dǎo)的整合酶基因共轉(zhuǎn)染，可在精原細(xì)胞中檢測到外源基因的表達(dá)，且病毒誘導(dǎo)的雙基因共轉(zhuǎn)染較單基因整合效率更高。但目前用這種方法獲得轉(zhuǎn)基因 動物還較難。
禽類輸卵管
對禽類輸卵管活體電穿孔的研究很少，但這一方法卻有很廣闊的發(fā)展前景。因為輸卵管腺體細(xì)胞具有很強的分泌功能，可以將大量蛋白分泌到雞蛋中。也可以利用此 瞬時表達(dá)系統(tǒng)檢測含卵清蛋白啟動子的載體功能。Park 等用活體電穿孔法以熒光素基因?qū)腚u輸卵管上皮，檢測到熒光素活性約4500RLUPmg 組織[15 ] 。
眼睛、胚胎和禽類胚盤
這三種組織都是很脆弱的，如果實施基因槍法，會使靶組織因強烈的機械損傷而失去功能或直接導(dǎo)致發(fā)育停滯。Sakamoto 將血纖蛋白溶酶原激活因子基因?qū)胙劬χ?，有效抑制了眼睛在淤傷后血纖蛋白的反應(yīng)。哺乳動物胚胎的電穿孔操作包括離體和**內(nèi)操作。禽類胚胎基本是在蛋殼 中進(jìn)行電穿孔的，而且表達(dá)快速，Momose 等報道電穿孔施加后215 小時在雞胚中就可以檢測到外源基因的表達(dá)，這在使用病毒載體時也是不可能的。當(dāng)電場被限定在一個很小的范圍內(nèi)時，基因可以定點表達(dá)， 這是活體電穿孔法的又一優(yōu)點，Katahira 等[17 ] 證實可將外源基因?qū)腚u胚大腦、心臟和一些微小組織(如中胚層，間充質(zhì)和體節(jié)) 中進(jìn)行表達(dá)。
6、 活體電穿孔法進(jìn)行基因**及外源基因表達(dá)的調(diào)控
6．1 活體電穿孔法在基因**方面的應(yīng)用
原來在基因**中利用活體電穿孔法將抗體或化療**導(dǎo)入腫瘤中，促進(jìn)抗體和化療**的運送來進(jìn)行**，現(xiàn)在則以特異的外源基因替代了抗體的應(yīng)用，簡化操作步驟同時降低了費用。
首先，在皮膚瘤和腦瘤的**中，電穿孔法可有效地將**基因?qū)?*部位。電穿孔法導(dǎo)入人單核細(xì)胞趨化物蛋白基因到大鼠腦瘤后，該蛋白在腫瘤的局部表達(dá)，同時在基因?qū)氲牟课豢捎^察到巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的聚集。
同時有科學(xué)家從另一角度研究電穿孔對**腫瘤方面的作用，利用高電場強度的陡脈沖促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生不可逆性電擊穿而*終死亡，這種方法很適于局部組織腫瘤的**。
此外，活體電穿孔法還可以參與癌癥的**，通過活體電穿孔法將基因?qū)霗C體后，導(dǎo)入組織可成為分泌抗體等物質(zhì)的臨時分泌器官，以抵**細(xì)胞的侵蝕或代償由于癌細(xì)胞的侵蝕而造成的機體多種生理機能的喪失。
除了可以利用活體電穿孔法對腫瘤進(jìn)行局部**外，還可以**機體的***系統(tǒng)和**系統(tǒng)的**?？稍跈C體局部以活體電穿孔法導(dǎo)入編碼分泌型蛋白的基因，這 種重組的**蛋白可以隨著血液循環(huán)分布到全身各種組織和細(xì)胞進(jìn)行**。如在活體電穿孔骨骼肌導(dǎo)入EPO 基因后，可通過紅細(xì)胞比容值檢測到EPO 基因表達(dá)產(chǎn)物的增加。Yasui 等在小鼠體內(nèi)檢測到活體電穿孔法導(dǎo)入的胃泌素基因的表達(dá)產(chǎn)物和人的單克隆抗體。
在不遠(yuǎn)的將來，研究人員可以選擇機體的一種組織的某個位置作為活體電穿孔的靶位點，將**基因從該位點導(dǎo)入進(jìn)而表達(dá)，因此又可以把這個特殊的組織當(dāng)作機體 的一個人造的***或**組織，對病人進(jìn)行相應(yīng)的**?；铙w電穿孔法可對系統(tǒng)**產(chǎn)生作用并且**有效。將不同類型的耐藥基因同時導(dǎo)入造血細(xì)胞，以擴大耐 藥范圍和進(jìn)行體內(nèi)選擇是基因**的重要策略，這類載體基因片段大多較長，進(jìn)行傳統(tǒng)基因?qū)胗幸欢ǖ碾y度。有報道可以用活體電穿孔法將醛脫氫酶基因和多藥耐 藥基因共轉(zhuǎn)移并在PA317 細(xì)胞中獲得高效表達(dá)，轉(zhuǎn)導(dǎo)率達(dá)98 % ，測定**蛋白表達(dá)較常規(guī)方法增高4 倍。此外電穿孔法有很高的經(jīng)皮促滲作用，可進(jìn)行很多經(jīng)皮給藥的**。
6．2 基因**中外源基因表達(dá)的調(diào)控
研究人員大都不希望導(dǎo)入的外源基因過度表達(dá)，尤其在基因**中，我們希望外源基因表達(dá)的誘導(dǎo)和抑制能夠得到控制。目前這方面的研究主要包括兩個方面:效應(yīng) 元件調(diào)節(jié)和生理活動調(diào)節(jié)。效應(yīng)元件的作用，例如類固醇類**誘導(dǎo)的效應(yīng)元件中，在卵清蛋白啟動子5′遠(yuǎn)端019kb 處有一個雌**效應(yīng)元件，將具有此元件的基因?qū)氤赡昴鸽u后，在其皮下注射糖皮質(zhì)**和雌**，便可誘導(dǎo)外源基因的高效表達(dá)，表達(dá)量較未經(jīng)**誘導(dǎo)的對照 組增加10 倍。
